บทนำ

    ในการสังเคราะห์สายเพปไทด์ด้วยวิธี Solid-Phase peptide Synthesis, (SSPS) ด้วยการใช้ Fmoc (9-fluorenyl methoxy carbonyl) นั้น ขั้นตอนสุดท้าย คือการตัดสายเพปไทด์ออกจากเรซิน โดยทั่วไปมักจะใช้สารละลายกรดไตรฟลูโอโรแอซีติก (TFA) เพราะว่าหมู่ปกป้อง (Protecting Group) ของหมู่โซ่ข้าง (Side Chain) จะถูกเอาออกด้วยกรด (Acid labile) จึงเป็นการทำงานเพียงขั้นตอนเดียวเพื่อตัดทั้งสายเพปไทด์ออกจากเรซินและนำ Protection Group ออกทั้งหมด  มีการใส่สารจับไอออน ( Seavenger molecule) ต่างๆลงใน TFA เพื่อป้องกันไม่ให้ไอออนที่เกิดขึ้นเมื่อ Protection Group  ที่หลุดออกมาจาก Side Chain กลับไปทำปฏิกิริยากับสายเพปไทด์ที่ไม่มี Protection Group

               การเลือกใช้ สารจับไอออน (Seavengers) ขึ้นอยู่กับลำดับของกรดอะมิโนในสายเพปไทด์นั้นๆ สำหรับสารจับไอออนที่ใช้กันทั่วไป ได้แก่

• น้ำกลั่น (เพื่อจับ t-butyl cations)
• Triisopropyl Silane, TIS (เพื่อจับ trityl และ Pbf cations)
• Ethane dithiol, EDT (เพื่อจับ t-butyl cations) ลดการเกิดปฏิกิริยาออกซิเดชั่นของหมู่โซ่ข้าง (Side Chain) กรดอะมิโน Cys/Met
• ฟีนอล (ป้องกันหมู่โซ่ข้าง กรดอะมิโน Tyr และ Trp จากออกซิเดชั่น)
• Thioanisole (ช่วยในการย้ายกลุ่มปกป้อง Pbf ออกจาก Arg (Pbf) ลดการเกิดออกซิเดชั่นของหมู่โซ่ด้านข้าง Cys/Met

              ในการตัดเพปไทด์ สามารถทำได้ทั้งในอุณหภูมิห้อง ช่วง 20-38 °C

   CEM แนะนำเครื่องตัดสายเพปไทด์ด้วยความร้อนแบบขนาน รุ่น Razor (Peptide Synthesis Cleavage System) สามารถตัดสายเพปไทด์ทั้งแบบสายเพปไทด์สายเดี่ยว (Single Peptide) และขนาดใหญ่

ตารางด้านล่าง แสดงตัวทำละลายที่ CEM แนะนำใช้ในขั้นตอนการตัดสายเพปไทด์ ทั้งที่อุณหภูมิห้องและอุณหภูมิสูง คำแนะนำการใช้สารละลายนี้ เหมาะสมกับการตัดสายเพปไทด์ทั่วไปรวมถึงการกำจัด Protection Group ของ Side Chain ทั้งหมดออกไปพร้อมกัน

คำเตือน

เครื่อง LIbety Blue ไม่สามารถทำการตัดสายเพปไทด์ หากต้องการตัดสายเพปไทด์จะต้องควรทำที่อุณหภูมิห้อง ด้วยเครื่อง Razor, Parallel Peptide cleavage System

การตัดสายเพปไทด์ที่อุณหภูมิห้องและที่อุณหภูมิสูง

1)     นำเรซินออกจากภาชนะสังเคราะห์

a)      ล้างเรซินในภาชนะ แล้วบรรจุในกระบอกฉีดยา (Syrings) ด้วย DCM (หรือจะใช้ DMF แทนก็ได้) อย่างไรก็ตาม DCM จะช่วยให้ล้างได้ง่ายกว่า ถ้าจำเป็นต้องใช้ DMF เรซินจำเป็นต้องล้างให้สะอาดด้วย DCM ก่อนที่จะนำไปตัดสายเพปไทด์

2)     เติมสารละลาย TFA จำนวน 4 mL (หรือประมาณ 2 เท่าของปริมาตรก้อนเรซิน) ลงในกระบอกฉีดยา

3)     สำหรับการตัดที่อุณหภูมิห้อง ให้ใช้เวลา 3 ชม. ในการตัดสายเพปไทด์ เว้นแต่ว่าสายเพปไทด์ประกอบด้วยกรดอะมิโน Arg จำนวนหลายๆหน่วย (residues) ให้เพิ่มเวลาในการตัดขึ้นอีก 15 นาที ต่อกรดอะมิโน Arg หนึ่งหน่วยแต่หลังจากกรดอะมิโน Arg หน่วยที่ 3 ห้ามใช้เวลาทั้งหมาดเกิน 5 ชั่วโมงในการตัดสายเพปไทด์

4)     สำหรับการตัดที่อุณภูมิสูงที่ 38 °C ให้ใช้เวลา 30 นาที ในการตัดสายเพปไทด์ เว้นแต่ว่าสายเพปไทด์ที่ประกอบด้วยกรดอะมิโน Arg จำนวนหลายๆหน่วย (residues) ให้เพิ่มเวลาในการตัดขึ้นอีก 5 นาที ต่อกรดอะมิโน Arg หนึ่งหน่วย แต่รวมเวลาทั้งหมดในการตัดสายเพปไทด์ ต้องไม่เกิน 45 นาที

5)     หลังจากการตัดสายเพปไทด์ สำเร็จแล้ว ให้นำของเหลวที่ได้ใส่ในหลอดขนาด 50 mL เครื่องปั่นเหวี่ยง (centrifuge)

6)     นำตะกอนของสายเพปไทด์ที่ตัดแล้ว ทำให้แห้ง ด้วย ice ether ปริมาณ 50 mL (หรือ 8 เท่า ของปริมาณของเหลวในข้อ 5 ) แต่ถ้าปริมาณเกิน 50 mL ให้ใส่แยกในหลอดที่ 2 ของเครื่องปั่นเหวี่ยง แต่ต้องมั่นใจว่าอีเธอร์ต้องถึงจุดเยือกแข็ง เพื่อให้ได้ปริมาณตะกอนของเพปไทด์มากที่สุด

7)     ให้ปั่นสารละลายเพปไทด์เป็นเวลา 5 นาที ที่ความเร็ว 3,500 รอบต่อนาที หรือจนกระทั่งได้เป็นตะกอนสีขาวหรือใสของเพปไทด์ที่อยู่ก้นหลอด ถ้าจำเป็นให้ทำขั้นตอนการปั่นเหวี่ยงซ้ำอีก เพื่อกำจัดอนุภาคแขวนลอยใดๆ ที่อาจมีอยู่

8)     ค่อยๆริน สารละลายอีเธอร์ออก ให้เหลือแต่ตะกอนของเพปไทด์ในหลอด

a)      เพปไทด์อาจแขวนลอยปะปนใน ice cold ether จึงจำเป็นต้องทำขั้นตอนการปั่นเหวี่ยงอีกครั้ง เพื่อให้แน่ใจว่าหมู่ปกป้องทั้งหมดได้ถูกกำจัดหมดแล้ว

9)     เพปไทด์ที่สังเคราะห์ได้ สามารถวิเคราะห์ด้วยเครื่อง HPLC หรือ UPLC ได้ทันทีเพื่อมั่นใจในความบริสุทธิ์ หรือสามารถทำให้แห้งแบบแช่เยือกแข็ง (lyophilized) เพื่อเก็บข้ามคืนไว้ก่อนการวิเคราะห์

a)      ในการทำให้แห้งแบบแช่เยือกแข็ง ให้ทำการแขวนลอยเพปไทด์ ในส่วนผสมของ 1% กรดอะซีติก กับน้ำ DI (deionized water) ตามด้วยขั้นตอนการแช่เยือกแข็งด้วยไนโตรเจนเหลว (-196 °C/ 77K) ก่อนที่จะใส่ในเครื่อง Lyophilizer

การป้องกันในการตัดสายเพปไทด์  :  บริเวณพื้นผิวของเรซินจะประกอบด้วย linker ซึ่งทำหน้าที่ในการเชื่อมต่อกรดอะมิโนตัวแรกเข้ากับเรซิน

เรซินที่มีตัวเชื่อม (Linkers) มีความไวต่อความเป็นกรดสูง ตัวอย่างเช่น  Cl-TCP (Cl) Protide สามารถถูกตัดได้โดยการใช้ 1% ของ TFA เพื่อสร้างเพปไทด์ที่ได้รับการปกป้อง ตามขั้นตอน ดังนี้

1. นำเรซินออกจากภาชนะสังเคราะห์

a)      ล้างเรซินจากภาชนะ แล้วบรรจุในกระบอกฉีดยา (Syringe) พร้อมกับ DCM (หรือจะใช้ DMF แทนก็ได้ แต่ก็ยังต้องล้างเรซินด้วย DCM ก่อนทำการตัด)

1. เติมสารละลาย 1% ของ TFA ประมาณ 3 mL (หรือ 2 เท่าของปริมาตรก้อนเรซิน) ลงในกระบอกฉีดยาที่มี DCM กับเรซิน ทิ้งไว้ประมาณ 2 นาที เกิดปฏิกิริยาตัดสายเพปไทด์ที่อุณหภูมิห้อง
2. กรองของเหลวที่ได้ ลงในหลอดของเครื่องปั่นเหวี่ยงที่มี 10% pyridine ปริมาณ 3 mL ใน MeOH
3. ทำซ้ำขั้นตอนการตัด & การกรอง (ข้อ 2-3) อีก 4 ครั้ง รวมเป็นทั้งหมด 5 ครั้ง
4. รวบรวมสารที่กรองได้ทั้งหมดใส่ในขวดก้นกลมปริมาตร 125 mL ล้างหลอดเก็บแต่ละหลอดด้วย MeOH
5. ใช้เครื่องระเหยแห้งสุญญากาศ (Rotary Evaporator) เพื่อระเหยสารละลายให้มีปริมาตรเหลือน้อยกว่า 3 mL
6. เทสารละลายที่เหลือ (จากข้อ 6) ลงในหลอดสะอาดของเครื่องปั่นเหวี่ยง (ขนาด 50 mL) และเติม MeOH จำนวนเล็กน้อย (น้อยกว่า 2 mL)
7. เติมน้ำ DI ที่อุณหภูมิ 0 ^oC ลงไป จนปริมาตรเพิ่มขึ้นเป็น 35 mL เพื่อให้ได้ตะกอนของเพปไทด์
8. นำสารละลายเพปไทด์ เข้าเครื่องปั่นเหวี่ยงเป็นเวลา 5 นาที ที่ความเร็ว 3,500 รอบ/นาที จนกระทั่งได้เม้ดดเพปไทด์สีขาวหรือใสที่ก้นหลอด ทำการปั่นเหวี่ยงซ้ำอีกครั้งเพื่อกำจัดอนุภาคแขวนลอยที่อาจะหลงเหลืออยู่
9. ค่อยๆรินน้ำออก จนเหลือแต่เพปไทด์ที่ตกตะกอนอยู่ในหลอด
10. นำเพปไทด์ที่สังเคราะห์ได้ ไปทำการวิเคราะห์ด้วยเครื่อง HPLC หรือ UPLC ทันที แต่ถ้าต้องการเก็บไว้วิเคราะห์ภายหลัง สามารถทำให้แห้งแบบแช่เยือกแข็ง (lyophilized) ดังนี้

a)      ในการทำให้แห้งแบบแช่เยือกแข็ง ให้ทำการแขวนลอยเพปไทด์ในส่วนผสมของ 1% กรดอะซีติกกับน้ำ DI (deionized water) ตามด้วยขั้นตอนการเยือกแข็งด้วยไนโตรเจนเหลว ก่อนทำการใส่ในเครื่อง Lyophilizer